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【儀器網(wǎng) 使用手冊】暗視場顯微鏡：使用特殊的暗視場聚光鏡使照明光線偏移而不進(jìn)入物鏡，只有樣品的散射光進(jìn)入物鏡。
注意事項
1、制作暗視場光擋時，若光擋直徑過小或光擋的中心位置不正，則不能全部擋掉直射光，視野不暗，樣品與背景的明暗反差不明顯;若光擋直徑過大，聚焦到樣品上的光線不足，使暗視野顯微鏡觀察到的樣品亮度不佳，影響觀察效果。
2、使用暗視野顯微鏡時，照明光源的照明強度要高，否則樣品的反射光強度不夠，影響觀察效果。
3、若視場中樣品與背景明暗反差不強時，可以上下調(diào)節(jié)聚光器的位置，使視場內(nèi)的反差提高。
4、要求使用的載玻片和蓋玻片必須無劃痕且無灰塵，物鏡前透鏡也必須清潔無塵。載玻片與蓋玻片的厚度應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)。載玻片太厚，聚光器的焦點將落在載玻片內(nèi)，達(dá)不到被檢物體的平面上;使用油鏡頭時，由于物鏡的工作距離很短，甚至無法調(diào)焦，從而看不到或看不清被檢物體。
5、載玻片的厚度要適宜，照明光束經(jīng)暗視野顯微鏡聚光器后，產(chǎn)生空心照明光錐，即中心為暗區(qū)。而反射光的焦點在聚光器上透鏡表面之上，很短的距離。因此，載玻片的適宜厚度為0.8～1.2mm。
6、物鏡的數(shù)值孔徑必須小于聚光器的數(shù)值孔徑，否則會因物鏡的孔徑角大于暗視野顯微鏡聚光器所形成的照明光束中心暗區(qū)的角度，致使部分照明光線射入物鏡，破壞或降低了暗視場的照明。
7、暗視野顯微鏡鏡檢時室內(nèi)要暗，如果沒有這樣的條件，應(yīng)盡可能使用遮光裝置，以阻止目鏡周圍的光線射入。
8、在進(jìn)行油鏡鏡檢時，由于油內(nèi)的雜質(zhì)和氣泡的漫反射，會妨礙暗視野顯微鏡鏡檢效果，所以要求盡可能地除掉油內(nèi)的雜質(zhì)和氣泡。
工作原理
暗視場顯微鏡在構(gòu)造上應(yīng)用丁達(dá)爾現(xiàn)象（Tyndall phenomenon:當(dāng)聚光光束射入溶膠時，從光束的側(cè)面可以看到一條發(fā)亮的光柱，在光的傳播過程中，光線照射到粒子時，如粒子直徑略小于入射光波長，則發(fā)生光的散射，每個微粒就成為一個發(fā)光點，從側(cè)面可以看到一條光柱。），裝配了一類特殊聚光器——暗視場聚光器，使入射光束，從聚光器斜向照明被檢樣品。由于照明光線與顯微鏡光軸形成較大的角度通過物場，或因聚光器的特殊構(gòu)造，照明光線在聚光器頂透鏡或蓋片的上表面發(fā)生全反射，致使照明光線不能入射物鏡之內(nèi)。但是，樣品被照明并發(fā)出反射光。鏡檢時，因不能直接觀察到照明光線，與光軸垂直的平面視場暗黑，在深暗的背景上能清晰地看到由散射光和反射光形成的明亮的物體影像，物像與背景造成很大的反差。視場內(nèi)的樣品，被斜射光線照明，可從樣品各種結(jié)構(gòu)表面散射和反射光線，看到許多細(xì)胞器的明亮輪廓，諸如細(xì)胞核、線粒體、液泡以及某些內(nèi)含物等。如果是正在分裂的細(xì)胞，其各類紡錘絲和染色體亦可窺見。
暗視場顯微鏡是利用樣品的散射光和反射光進(jìn)行觀察，所以只能看到物體的存在與運動而不能辨清其微細(xì)結(jié)構(gòu)。暗視場顯微鏡的檢測能力，取決于入射光的強度和視場的反差，后者又隨微粒及其背景的折射率差別的加大而增加。
暗視場顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有別。確切地說，稱暗視場顯微鏡為暗視場照明更為貼切。暗視場照明是斜向照明的一種，這種照明法能提高對微小物體的分辨能力，對大小在0.004μm以上的微小粒子，盡管看不清楚其結(jié)構(gòu)，亦可清晰地分辨其存在和運動。
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