QQ交談
您所在位置：請輸入產品關鍵字：
暫無信息 |
免疫電鏡步驟
點擊次數：2239 發布時間：2021-2-23
免疫電鏡技術的操作程序分為抗體的制備，標本的處理，免疫標記，對照實驗、結果的觀察和解析五部分。
1.抗體的制備：
特異性高、親和力強的高效價抗體是獲得理想的免疫標記結果的首要條件要。抗體可購買或自己制備。大分子*抗原，可直接免疫動物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠來獲得抗體。半抗原，用偶聯劑使半抗原與大分子物質結合成復合物，再去免疫動物產生抗體，大分子物質稱為載體蛋白，以甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白或血藍蛋白常用。偶聯劑為戊二醛或碳二酰亞胺等。目前細胞雜交瘤技術制備的單克隆抗體理想。
2.標本的處理
A、為了既能將抗原準確定位甚至定量，又能觀察到近似于生活狀態下的細胞超微結構，必須選擇合適的固定劑，慎重處理樣品。
1）單細胞：培養細胞或血細胞應隨用隨取。懸浮培養細胞可先離心（800 rpm，5 min），用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗1次后進行固定。貼壁細胞則可先將其培養在玻片上，用PBS輕輕沖洗后立即固定，也可用*將細胞消化下來，按懸浮培養細胞的制備方法制備。
2）組織：取組織塊時做到越快越好，在沒有停止血流前就取材。若觀察的對象為肺、大腦、脊髓或內分泌器官等比較柔軟的組織，應先做灌注固定，再用銳利的刀片將其切成約2 mm×2 mm×l mm大小的組織塊，切時要避免擠壓與牽拉，然后投入到固定液中繼續固定。
3）固定： 固定劑常會對抗原的活性產生不同程度影響，為了保存細胞的超微結構和抗原的活性，應通過預試驗，確定固定劑的種類、濃度、溫度、pH及固定時間和方式，可用已知效價的抗原進行試驗，選擇合適的固定方法。
B、以下是常用的免疫電鏡標本固定液的類型
（1）多聚甲醛-戊二醛固定液（簡稱PG）：1％多聚甲醛對組織細胞的抗原性影響不大，若加入超過0.1％戊二醛，抗原性就會迅速減弱；當戊二醛的濃度低到0.01％～0.05％時，對抗原性的影響便不顯著，而細胞超微結構的保存也可獲得很大改善。所以推薦用1％多聚甲醛加0.01％～0.05％戊二醛作為免疫電鏡標本的固定劑，固定時間為4～5 h。對有些抗原性較強的標本，也可采用4％多聚甲醛加0.05％～0.5％戊二醛進行固定。某些抗原對戊二醛極其敏感，固定液只能用2～4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。不充分的固定會造成抗原提取或移位，同時醛類等交聯固定劑會改變蛋白質分子的結構而影響其抗原性，所以在不明顯影響抗原性的前提下，選擇合適的固定濃度和時間，盡可能強一些為好。
（2）過酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛混合固定液（簡稱PLP）：PLP液含0.01 mol/L過酸鈉、0.075mol/L賴氨酸、2％多聚甲醛及0.037mol/L磷酸緩沖液。其機制是借助過酸鹽氧化抗原，一般為糖蛋白的糖類部分，使其羥基變為醛基，這樣賴氨酸的雙價氨基就能與醛基結合從而把抗原交聯起來。由于大多數組織抗原含蛋白質與糖類，抗原決定簇位于蛋白部分，該固定劑有選擇性地固定糖類，這樣既穩定了抗原，又不影響抗原決定簇與抗體的結合。加入低濃度的多聚甲醛則能穩定蛋白與脂類。因為賴氨酸價格較貴，此固定液不如PG固定液經濟。
（3）-多聚甲醛-戊二醛固定液（簡稱PAPG）：PAPG液含4％多聚甲醛、15％（V/V）、0.5％戊二醛、pH為7.3。穿透迅速，可在不影響抗原活性的前提下固定蛋白質，改善對膜和胞質的保存。特別是不能采用高濃度的戊二醛與鋨酸做后固定時（如包埋后的免疫標記），在前固定液中加入對超微結構的保存有很大幫助。
C、固定方法與時間
1）灌注固定：這是固定效果的方式，能使超微結構得到很好的保存。以大鼠為例，麻醉后，用注射針頭經左心室向主動脈灌注固定液，靜脈壓為120mm Hg柱，在5～15 min內每200g體重灌注150 ml固定液。
2）浸沒固定：將手術或灌注后切成的標本塊浸沒在固定液中固定，浸沒固定時間常為2～5h，游離細胞固定0.5～1h。
3）包埋，包埋劑類型：環氧樹脂包埋劑和低溫包埋劑。
1）包埋前免疫標記
即對已固定的樣品*行免疫標記，然后進行包埋、超薄切片并觀察結果，一般選用環氧樹脂包埋劑。環氧樹脂本質是疏水性的，在包埋前樣品必須*行*脫水，然后在溫箱中進行熱聚合。熱聚合會使大多數抗原變性，因此該包埋劑不適用于包埋后免疫標記。
2）包埋后免疫標記
指組織標本經固定及樹脂包埋，制作成超薄切片后再進行免疫化學標記的方法，此方法多用低溫包埋劑，如Lowicryl系列包埋劑、LR White包埋劑和LRGold包埋劑。這三種包埋劑均能在低溫下（-35℃～-80℃）用紫外光（波長315～360nm）進行聚合，避免了高溫對抗原性的負面影響，提高了陽性標記率，而且對膠體金的非特異性吸附少，對溫度敏感的抗原應選擇使用低溫包埋劑。
3.免疫標記
根據免疫標記與標本包埋之間的不同關系，可分為包埋前免疫標記、包埋后免疫標記和不用包埋的冷凍超薄切片免疫標記。根據具體的標本、抗原的部位及性質并結合實驗室的具體條件選擇恰當的方法。這三種免疫標記方法，都包括非特異性位點的封閉、抗體與抗原特異性結合的免疫反應、反應部位的示蹤顯示等基本步驟。
1）包埋前免疫標記
優點一是切片在免疫標記前不經鋨酸固定、脫水、樹脂包埋及高溫聚合的過程，抗原活性不會受到上述過程的影響，而且抗原暴露充分，標記的陽性率高，非特異性反應少。優點二是免疫標記后還可進行半薄切片，在免疫反應陽性部位做定位超薄切片，進一步提高電鏡的檢出率。優點三是免疫標記完畢后，用戊二醛與鋨酸再次固定組織，可使抗原抗體的結合更加牢固，并有利于膜結構的保存。
包埋前免疫標記主要用于細胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脫水劑和樹脂成分溶解和變性的抗原的檢測。包埋前免疫標記細胞內抗原受到標記抗體的穿透性限制，為了提高對細胞內抗原的標記率可以采取以下措施：
（1）厚切片
厚切片進行包埋前免疫標記，需將固定后的組織厚切片（單細胞團不需厚切片），以利于標記抗體的穿透。厚切片的方法有以下幾種：
1) 冰凍切片
用恒冷箱冰凍切片機將固定后的組織塊切成8μm左右的厚片。將切下的厚片放入盛有PBS的小玻璃瓶內備用。也有的將厚片直接貼在載玻片上進行免疫標記，這樣做雖然操作比較方便，但因抗體只能與厚片的一面接觸，所以會在一定程度上影響標記的陽性率。
2) 振動切片
振動切片可以切出20μm～30μm的厚片，免疫電鏡用只需20μm～80μm的切片。振動切片的優點是可以避免冰凍對組織帶來的損害，但它切出來的切片過厚，即使在使用穿透劑的條件下，免疫試劑也僅能穿透切片表面8μm～9μm，而更深層的組織就不易被標記。
（2）增加細胞膜的通透性
用0.01％Saponin或0.1％Triton X-100等活性劑處理5～8min，以增加細胞膜的通透性。但這些化學物質會對超微結構產生一定程度的破壞，所以應根據不同的組織或細胞，嚴格控制活性劑的應用濃度與時間。也可用凍融的方法增加細胞膜通透性，標本*行防冰晶處理（厚片在含15％甘油、20％蔗糖的PBS中振搖沉底），在液氮中速凍0.5～1min后用PBS迅速回溫。
（3）選用相對分子質量較小的標記物
辣根過氧化物酶與IgG的Fab片段交聯物，分子質量較小，約100kD，較易進入細胞內。也可用IgG Fab-lnm金作為標記物，標記后經銀加強染色的納金包埋前標記法。由于該標記物較易穿透到組織和細胞內，且定位比酶標抗體精確，因此被廣泛用于膜受體的精確定位。
2）包埋后免疫標記
包埋后免疫標記具有超微結構保存較好、方法簡便可靠、陽性結果重復性高的優點，可對同一組織塊的連續切片做各種對照免疫標記，能十分準確地解釋免疫標記結果，而且還能在同一張切片上進行多重免疫標記，尤其適合于顆粒性標記物（膠體金標記）的免疫化學定位標記，是目前應用的免疫電鏡技術。但是該方法也有明顯的缺點，抗原在脫水、浸透及樹脂包埋過程中可能被破壞，且抗原被樹脂遮蓋不易與抗體接觸，使免疫標記的陽性率下降。尤其是后固定劑鋨酸對抗原的破壞較嚴重，因此常常避免使用。為了得到精細的超微結構并提高陽性標記率，必須注意以下幾個方面：
3）冷凍超薄切片免疫標記
冷凍超薄切片免疫電鏡技術的特點是組織不經脫水包埋直接冷凍，在冷凍狀態下進行超薄切片，然后進行免疫標記。該項技術克服了上述兩種方法的缺點，能更理想地保存一些生物大分子的活性，極大地提高了免疫標記的敏感性，但在冷凍過程中超微結構會受到冰晶的破壞。1996年，LiouW等改良了冷凍超薄切片技術，用甲基纖維素和醋酸鈾混合液（含1.5％～2％甲基纖維素，0.3％～3％醋酸鈾的水溶液）代替傳統的蔗糖溶液作為將冷凍切片從冷凍槽中轉移到鎳網上的溶液，得到了保存良好的超微結構，使該項技術更加完美，應用也越來越廣泛。但該項技術必須有特殊的冷凍超薄切片機，且技術難度較高。
4.對照實驗
為了證實免疫標記結果的特異性，必須同時進行對照實驗。在抗體的特異性無問題的前提下，對照實驗有以下幾種：
用未經免疫的同種動物正常血清代替抗體，結果應為陰性。 不加一抗，結果應為陰性。 用不含有靶抗原的標本進行免疫標記，結果應為陰性。 對肯定含有靶抗原的標本進行免疫標記，結果應為陽性。
5.結果的觀察和解析
在電鏡下觀察免疫標記的結果，通過標記物（膠體金、鐵蛋白或酶底物）顯示免疫反應部位以定位抗原的存在位置，注意區分特異性標記和背景的非特異性標記，進行正確的結果分析。