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免疫組化、免疫熒光、流式細胞術應用比較及常見問題分析
點擊次數：6559 發布時間：2021-2-23
一、免疫組織化學（Immunohistochemistry,IHC）
1、原理和特點
? 原理：利用抗原與抗體的特異性結合原理和特殊的標記技術，通過化學反應使標記抗體顯色，對組織細胞內的特異性抗原進行定位、定性、定量檢測的一門技術。
? 特點：免疫組化具有操作簡單，特異性強，敏感性高，定位準確，形態與功能相結合等特點。
2、示意圖：
辣根過氧化物酶（HRP）
3、常見問題分析：
A.顯色過深
? 一抗濃度過高或孵育時間過長，建議降低一抗濃度或減少孵育時間。
? 孵育溫度過高，建議室溫或4℃孵育。
? HRP標記二抗孵育時間過長，建議縮短時間。
B. 非特異性顯色
? 石蠟切片脫蠟不*，建議延長脫蠟時間。
? 操作過程中沖洗不充分，建議增加沖洗的次數與沖洗時間。
? 組織富含內源性的*與過氧化物酶，建議使用相關試劑進行封閉。
? 發生抗原異位。
? 蛋白封閉不充分，建議增加蛋白封閉時間。
C. 顯色強度弱
? 一抗濃度過低或孵育時間過短，建議增加一抗濃度或延長孵育時間。
? 試劑超過保質期，建議實驗前確認試劑的保質期。
操作過程沖洗過度，建議適度沖洗。
D. 無染色
? 組織中無目的抗原的表達。
? 一抗種屬來源與二抗不匹配，建議實驗前確認一抗的種屬來源。
? 顯色物質與HRP系統不匹配，建議實驗前確認顯色體系。
二、免疫熒光（Immunofluorescence,IF）
1、原理和特點：
? 原理：免疫熒光就是利用抗原與抗體的特異性結合原理及特殊的熒光素標記技術，通過激光激發使熒光素發出熒光，在熒光顯微鏡下觀察熒光的變化從而對細胞內的抗原進行分析的技術。用免疫熒光顯示和檢查細胞或組織內抗原或半抗原物質等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）技術。
? 特點：免疫熒光具有特異性強、敏感性高、速度快等特點。
2、原理示意圖：
3、實驗流程：
4、常見問題分析：
A、背景過高
? 一抗質量不高，建議使用特異性高、效價高的一抗。
? 一抗/二抗濃度太高，建議降低一抗/二抗濃度。
? 封閉不*，建議增加蛋白封閉時間。
? 洗滌不充分，建議增加沖洗次數與時間。
? 可通過調節熒光顯微鏡的參數來減低背景。
B、信號弱或無信號
? 無目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細胞或組織。
? 細胞通透性差，建議增加通透劑的作用時間或濃度。
? 一抗/二抗濃度太低，建議增大其濃度。
? 二抗選擇錯誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。
C、熒光猝滅快
? 熒光素本身特性決定，光穩定性差，建議選用光穩定性好的熒光素二抗。
? 用普通的封片劑封片，建議選用防熒光猝滅劑封片。
D、細胞有自發熒光
? 使用了戊二醛固定，建議在固定后熒光染色前進行熒光淬滅，如使用NaIO4，NaBH4，*等，染色前檢查自發熒光。
? 材料本身（如石蠟）有自發熒光，建議設立陰性對照，通過降低熒光顯微鏡的參數來消除背景染色。
? 細胞成分中能夠產生自發熒光的分子（例如核黃素、細胞色素等）的含量高；培養細胞中死細胞／活細胞比例高；
三、流式細胞術（Flow Cytometry, FC）
1、定義、原理
? 流式細胞儀（FLOW CYTOMETOR）：
進行流式細胞分析的儀器，是集光電子物理，光電測量，計算機，細胞熒光化學，抗體技術為一體的高科技細胞分析儀。
? 流式細胞術（FLOW CYTOMETRY）：
利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數、快速（每秒可達1000-10000個）的定量分析和分選（純度可達99%以上）的技術。
2、反應原理示意圖：熒光物質（FITC、PE等）
3、實驗流程：
4、常見問題分析：
A、熒光強度/背景過高
? 一抗/二抗濃度太高，建議降低一抗/二抗濃度。
? 封閉不*，建議增加蛋白封閉時間。
? 洗滌不充分，建議增加沖洗次數與時間。
B、信號弱或無信號
? 無目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細胞。
? 細胞通透性差，建議增加通透劑的作用時間或濃度。
? 一抗/二抗濃度太低，建議增大其濃度。
? 二抗選擇錯誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。
C、柱形圖分析時出現熒光雙峰
? 抗原本身特性所決定（比如不同時期的細胞蛋白表達量不同）
? 進樣針堵塞，建議清洗管路。
? 進樣速度太快，建議調低進樣速度。
D、管路系統偏移導致焦距偏離，建議請專業維修人員校準。
四、免疫組化（IHC）、免疫熒光(IF)、流式細胞術區別(FC)：
流式細胞術（FC） | 免疫組化（IHC）、免疫熒光（IF） | |
控制 | 電腦（客觀） | 人（主觀） |
結果顯示方式 | 熒光激發后被探測子捕獲信號 | 化學顯色/熒光通過顯微鏡觀察拍片 |
樣本 | 單細胞（或顆粒）懸液（流動） | 組織切片/細胞爬片（靜止） |
細胞數量 | 大（上萬個） | 小 |
樣本利用 | 分選后可回收利用 | 不可回收利用 |
結果揭示信息 | 細胞群體特征分布 | 揭示細胞內部結構信息 |
功能 | 可同時檢測多個參數 | 一個或幾個參數 |